Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet

Obrana doktorskog rada :: Ivana Rajnović, dipl.ing.agr.

Datum održavanja:

Bioraznolikost i simbiozna učinkovitost prirodnih populacija rizobija koje noduliraju grah (Phaseolus vulgaris L.)
19. srpnja  2017. :: 11:00 sati :: Velika vijećnica

Povjerenstvo za ocjenu teme doktorskog rada:

  • red. prof. dr. sc. Milan Poljak, Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet
  • izv. prof. dr. sc. Nina Toth, Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet
  • izv. prof. dr. sc. Ksenija Markov, Sveučilište u Zagrebu Prehrambeno-biotehnološki fakultet

Mentorica:

  • prof.dr.sc. Sanja Sikora, Sveučilište u Zagrebu Agronomski fakultet

SAŽETAK

Putem simbiozne fiksacije dušika mahunarke mogu zadovoljiti velik dio svojih potreba za dušikom na učinkovit i ekološki prihvatljiv način. Rizobije su skupina bakterija tla sa jedinstvenom sposobnošću tvorbe kvržica na korijenu mahunarki u kojima pomoću enzima nitrogenaze konvertiraju inertan atmosferski dušik u biljkama pristupačan amonijačni oblik. Zbog svog vrlo vrijednog hranidbenog sastava, grah se smatra jednom od najvažnijih mahunarki u ljudskoj prehrani. Unatoč vrlo povoljnim agroekološkim uvjetima, uzgoj graha u Republici Hrvatskoj je zanemaren i u stalnom padu. Brojne vrste rizobija mogu tvoriti simbiozne odnose sa grahom, međutim u tlu su često prisutni kompetitivni autohtoni sojevi tih bakterija koji su dobro prilagođeni na nepovoljne uvjete, no njihova simbiozna učinkovitost je uglavnom nepoznata. Glavne pretpostavke ovih istraživanja su da u tlima sjeverozapadne Hrvatske postoje autohtoni sojevi rizobija koji noduliraju grah te da se oni značajno razlikuju po genotipskim i fenotipskim svojstvima te po učinkovitosti u simbioznoj fiksaciji dušika. U cilju odabira najkvalitetnijih sojeva rizobija sakupljeni su uzorci tla iz područja sjeverozapadne Hrvatske u kojem postoji dugogodišnja tradicija uzgoja graha. Iz 27 uzoraka tala izolirano je 45 autohtonih sojeva rizobija koji su zatim  identificirani molekularnim metodama. Izolati su najprije identificirani MALDI-TOF (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight) masenom spektrometrijom koja se bazira na analizi ukupnih ribosomalnih proteina. U dosadašnjim istraživanjima potvrđena je pouzdanost ove brze i osjetljive metode za identifikaciju brzorastućih i spororastućih rizobija. Pomoću RAPD (engl. random amplified polymorphic DNA) metode dobiven je uvid u genetsku raznolikost izolata te izvršeno grupiranje u 15 skupina iz kojih su odabrani reprezentativni izolati za daljnja istraživanja. Ona su uključila sekvenciranje 16S rRNA, atpD, recA i nodC gena što danas predstavlja standard u identifikaciji rizobija. Fenotipska karakterizacija uključila je utvrđivanje rasta na različitim temperaturama, pH vrijednostima, koncentracijama NaCl-a, sposobnosti iskorištavanja različitih izvora ugljika te otpornosti na antibiotike. U vegetacijskom pokusu ispitana je simbiozna učinkovitost 15 odabranih sojeva koja je uspoređena sa referentnim sojem, nebakteriziranom kontrolom te nebakteriziranom kontrolom uz dodatak mineralnog dušika. Drugi faktor pokusa bile su tradicionalne hrvatske sorte graha, Trešnjevac i Slavonski zeleni. Rezultati identifikacije autohtonih sojeva ukazuju na vrlo veliku raznolikost rizobija koji noduliraju grah u tlima sjeverozapadne Hrvatske. Rezultati MALDI-TOF MS analize pokazuju da se izolati iz ovog istraživanja podudaraju s vrstama Rhizobium leguminosarum, Rhizobium sophoriradicis, Rhizobium phaseoli, Rhizobium ecuadorense, Rhizobium acidisoli, Rhizobium indigoferae i Rhizobium pisi. Neke od ovih vrsta imaju gotovo identične 16S rRNA gene zbog čega je bilo neophodno analizirati sekvence njihovih konstitucijskih gena  atpD i recA. Prema tim analizama, najzastupljenije vrste iz uzorkovanih tala su R. leguminosarum i R. hidalgonense koja je tek nedavno otkrivena u američkim tlima. Sekvence atpD i recA gena velikog broja sojeva (35 %) značajno se razlikuju od najbližih srodnih vrsta zbog čega se može pretpostaviti da predstavljaju potencijalno novu vrstu unutar roda Rhizobium. Analiza nodC gena pokazala je da svi izolati pripadaju simbiovaru phaseoli, a u ovom istraživanju prvi put je utvrđeno postojanje simbiovara phaseoli kod vrste R. pisi. Dokazana je različita otpornost sojeva na stresne uvjete u tlu od čega je najznačajnija karakteristika otpornost na nizak pH jer su brojna tla u Hrvatskoj kisela. Rezultati vegetacijskog pokusa pokazuju da je najveća masa suhe tvari kvržica utvrđena primjenom sojeva 26T (R. hidalgonense) i 22AT (R. pisi). Na biljkama bakteriziranim sojevima vrste R. leguminosarum (16T, 23T, 1AT i 2Z) utvrđena je najveća masa suhe tvari kao i najveća količina dušika u suhoj tvari biljke što upućuje na njihovu veću simbioznu učinkovitost. Zbog toga bi ove sojeve bilo korisno uključiti u daljnje programe selekcije.

Ključne riječi: simbiozna fiksacija dušika, Rhizobium, grah (Phaseolus vulgaris), MALDI-TOF MS, RAPD, rrs, atpD, nodC, simbiozna učinkovitost